เมื่อวันที่ 28 สิงหาคม พ.ศ. 2533 ศาสตราจารย์ ดร.ณัฐ ภมรประวัติ อธิการบดีมหาวิทยาลัยมหิดลและดร.โกวิทวรพิพัฒน์อธิบดีกรมสามัญศึกษาได้ร่วมลงนามในโครงการความร่วมมือจัดตั้งโรงเรียนมัธยมศึกษาบนพื้นที่ของมหาวิทยาลัยมหิดล ตำบลศาลายากิ่งอำเภอพุทธมณฑลจังหวัดนครปฐมโดยมีวัตถุประสงค์เพื่อส่งเสริมนักเรียนที่สำเร็จการศึกษาระดับมัธยมศึกษาตอนต้นทั้งในส่วนกลางและส่วนภูมิภาคที่มีความสนใจและความถนัดทางด้านคณิตศาสตร์และวิทยาศาสตร์โอกาสเข้าศึกษาต่อในระดับมัธยมศึกษาตอนปลายในสิ่งที่ตนเองถนัดและสนใจได้อย่างกว้างขวางมากยิ่งขึ้น ทั้งนี้เพื่อให้นักเรียนเหล่านั้นได้รับการพัฒนาส่งเสริมให้มีความรู้ ทักษะ และประสบการณ์ด้านคณิตศาสตร์และวิทยาศาสตร์ที่ถูกต้องลึกซึ้งและกว้างขวางตามศักยภาพของตนเองให้มากที่สุดอันจะเป็นพื้นฐานในการศึกษาระดับสูงขึ้นไปและเป็นกำลังสำคัญในการพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีของชาติ อีกทั้งเพื่อศึกษาวิจัยหารูปแบบที่เหมาะสมในการจัดการเรียนการสอนวิทยาศาสตร์สำหรับเด็กไทย เพื่อพัฒนาสู่ความเป็นเลิศทางด้านวิทยาศาสตร์ควบคู่ไปกับการมีคุณธรรมและจริยธรรมที่ดีงาม บนพื้นฐานทางวัฒนธรรม ประเพณี ความศรัทธาค่านิยมที่ดีงามของไทย ในการนี้มหาวิทยาลัยมหิดลได้ตกลงให้ความร่วมมือกับกรมสามัญศึกษาในการสนับสนุนทางด้านวิชาการ รวมถึงให้ใช้บริการและสิ่งอำนวยความสะดวกต่าง ๆ ของมหาวิทยาลัย ในการจัดกิจกรรมต่าง ๆ เช่น ห้องปฏิบัติการ ห้องสมุด สนามกีฬา เป็นต้น
สมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาฯ สยามบรมราชกุมารี ทรงพระกรุณาโปรดเกล้า ฯ พระราชทานนามโรงเรียนนี้ว่า“มหิดลวิทยานุสรณ์”ตามคำกราบบังคมทูลของกรมสามัญศึกษา ต่อมาในปี พ.ศ. 2535 โรงเรียนได้รับพระราชทานพระบรมราชานุญาตจาก พระบาทสมเด็จพระเจ้าอยู่หัว ให้ใช้พระราชลัญจกร “มหิดล” เป็นตราสัญลักษณ์ประจำโรงเรียน
โรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์เปิดทำการสอนระดับมัธยมศึกษาตอนปลายรุ่นแรกในปีการศึกษา 2534 ตามประกาศ กระทรวงศึกษาธิการจัดตั้งโรงเรียนมัธยมศึกษาลงวันที่ 8 พฤษภาคม 2534 โดยได้รับความอนุเคราะห์จากพระอุบาลีคุณูปมาจารย์เจ้าอาวาสวัดไร่ขิง รองเจ้าคณะจังหวัดภาคที่ 14 วัดไร่ขิงอนุญาตให้ใช้สถานที่ปฏิบัติธรรมของวัดไร่ขิง ต.วัดไร่ขิง อ.สามพราน จ.นครปฐม เป็นสถานที่เรียนชั่วคราวจนกระทั่งในปี พ.ศ. 2538 โรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์ จึงได้ย้ายมาอยู่ ณ สถานที่ตั้งบนพื้นที่ของมหาวิทยาลัยมหิดลจวบจนปัจจุบัน
เมื่อวันที่ 25 สิงหาคม พุทธศักราช 2543 ได้มีการประกาศพระราชกฤษฎีกาจัดตั้งโรงเรียนมหิดลวิทยานุสรณ์ขึ้นเป็นโรงเรียนวิทยาศาสตร์แห่งแรกของประเทศไทย เปิดสอนในระดับมัธยมศึกษามีสถานภาพเป็นองค์การมหาชน ภายใต้การกำกับดูแลของรัฐมนตรีว่าการกระทรวงศึกษาธิการ การจัดตั้งเป็นองค์การมหาชน ทำให้โรงเรียนสามารถดำเนินการบริหารจัดการให้เยาวชนที่มีความสามารถพิเศษได้รับการพัฒนาอย่างเต็มศักยภาพ โรงเรียนมีอิสระในการดำเนินงาน รวมทั้งการพัฒนาหลักสูตรและสื่อที่มีลักษณะเฉพาะตัว แตกต่างจากโรงเรียนมัธยมศึกษาปกติโดยทั่วไป ภารกิจสำคัญของโรงเรียนคือ การวิจัย พัฒนา และสร้างองค์ความรู้ในการค้นหาและการจัดการศึกษาสำหรับผู้มีศักยภาพสูงด้านวิทยาศาสตร์ คณิตศาสตร์ และเทคโนโลยี ระดับมัธยมศึกษาที่สามารถใช้เป็นต้นแบบขยายผลในวงกว้างได้ ทั้งนี้เพื่อพัฒนานักเรียนเหล่านั้นให้มีความสามารถระดับมาตรฐานโลกมีจิตวิญญาณของความเป็นนักวิจัย นักประดิษฐ์คิดค้น มีสุขภาพพลานามัยที่ดี มีคุณธรรม จริยธรรม รักการเรียนรู้ มีความเป็นไทย มีความมุ่งมั่นในการพัฒนาประเทศชาติและมีเจตคติที่ดีต่อเพื่อนร่วมโลกและธรรมชาติเป็นตัวป้อนที่มีคุณภาพสูงเยี่ยมเข้าสู่ระดับอุดมศึกษาเพื่อพัฒนาไปสู่ความเป็นนักวิชาการนักวิจัยและนักประดิษฐ์คิดค้นระดับมาตรฐานโลกของประเทศชาติในอนาคต